Untitled Document
การตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัยประเภทของ Thalassemia
การตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อการวินิจฉัย Thalassemia ได้แก่
  1. การตรวจ CBC โดยใช้ automate blood cell analyzer
  2. การตรวจ Screening ด้วย OF, DCIP
  3. การตรวจ Hb Typing  ในที่นี้จะกล่าวเฉพาะวิธี Automate HPLC (High Performance Liquid Chromatography) โดยใช้เครื่อง Variant TM BIO - RAD
  4. การตรวจ globin gene โดยเทคนิค PCR (Polymerase Chain Reaction)  โดยตรวจ Thalassemia ที่พบบ่อยในประเทศไทย ได้แก่ Thalassemia 1(_ _ SEA type) , Thalassemia 2 ทั้งชนิด Rightward (-3.7) deletion และ Leftward (-4.2)  deletion , และ Hb CS

การตรวจ CBC โดยใช้ automate blood cell analyzer  โดยจะดู Parameter ดังต่อไปนี้
  1. MCV (Mean Corpuscular Volume) เป็นค่าเฉลี่ยของ RBC มีหน่วยเป็น femtoliter (fl) จะใช้ MCV < 80 fl เป็นตัว Screening ว่าอาจมีความผิดปรกติ (ทั้ง Trait หรือ Disease)
  2. RDW (Red Cell Distribution Width)  เป็นค่าความกว้างการกระจายตัวของเม็ดเลือดแดงที่มีปริมาตรต่างกัน แสดงถึงภาวะ anisocytosis ว่ามีมากน้อยเพียงไร ได้จากการคำนวณสัมประสิทธิความแปรปรวนมีหน่วยเป็น %  ค่าที่บ่งบอกว่าน่าจะมีความผิดปรกติคือ RDW > 14%
  3. HDW (Hemoglobin Distribution Width)  เป็นค่าความกว้างการกระจายตัวของความเข้มข้น Hb
  4. CHCM คือค่าเฉลี่ยความเข้มข้นของ Hb ใน RBC วัดจาก RBC แต่ละเซลแล้วมาหาค่าเฉลี่ยมีหน่วยเป็น g/dl
  5. % micro คือจำนวน microcyte มีหน่วยเป็น %
  6. % hypo คือจำนวนเม็ดเลือดแดงที่มี hypochromia แสดงเป็น %
 
MCV<80
MCV >80
RDW>14
RDW < 14
RDW>14
RDW <14
%H,M
%H,M
%H,M
%H,M
%H,M
%H,M
%H,M
%H,M
>30
<30
>30
<30
>30
<30
>30
<30
thal 1 trait
52%
41%
3%
4%
thal 2 trait
9%
23%
15%
20%
4%
23%
็Homozygous thal 2
15%
62%
23%

H= Hypochromic red cell , M - Microcytic Red cell , MCV = Mean Corpuscular Volume ,RDW = Red Cell Distribution Width
** จากหนังสือ  Thalassemia From Molecular Biology to Clinical Medicine หน้า 27
จากตาราง จะส่งตรวจ Thalassemia 1 trait หรือ Homozygous Thalassemia 2 เมื่อ
1. MCV <80 fl  และ RDW >14%
2. MCV <80 fl  และ RDW <14% แต่มี % Micro หรือ % Hypo = 30%
3. MCV >80 fl  และ RDW >14% แต่มี % Micro หรือ % Hypo = 30%


การตรวจ Screening ด้วย OF, DCIP
  1. OF (Osmotic Fragility Test) การตรวจหาความเปราะของเม็ดเลือดแดงในน้ำเกลือความเข้มข้น 0.36 % ซึ่งโดยปรกติเม็ดเลือดแดงของคนปรกติจะแตกหมด (เรียกว่าผล negative)  แต่เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วย Thalassemia หรือผู้ที่มี Gene แฝงจะแตกน้อยในน้ำเกลือที่มีความเข้มข้นนี้  เรียกว่ามี Decrease osmotic fragility (เรียกว่าผล positive) อย่างไรก็ตาม Fe Deficiency ก็สามารถให้ OF +ve ได้เช่นเดียวกัน  ในทางตรงกันข้าม OF สามารถ -ve ได้ในกลุ่มที่เป็น Trait ได้แก่ - thal 1 trait , E trait ,Hb CS trait
  2. DCIP(Dichlorophenol-indophenol) Precipitation test  สี DCIP มีคุณสมบัติทำให้ Hb ที่ไม่ stable สลายตัวและตกตะกอน  จึงสามารถตรวจหา Hb E,Hb H , และ Hb ที่ไม่ stable Hb ต่่างๆได้  วิธีนี้ทำได้ง่ายได้ incubate สีกับเม็ดเลือดแดงที่ 37 องศา C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วดูลักษณะของตะกอนที่เกิดขึ้น   (Fe Deficiency ก็สามารถทำให้ DCIP + ve ได้เช่นกัน)
    ** หมายเหตุ
    1. เราอาจจะใช้ MCV เพื่อเป็น Screening test แทน OF ก็ได้  โดย MCV < 80 fl แสดงว่า Screening test + ve
    2.ในกรณีที่ Screening ด้วย OF หรือ MCV +ve แล้ว ถือว่ารายนี้ + ve ไม่จำเป็นต้องทำ DCIP Precipitation test ต่อ แต่ถ้าทำ OF หรือ MCV แล้ว - ve ต้องตามด้วย DCIP  โดยถือว่าถ้ามีผล + ve อย่างไรอย่างหนึ่ง แสดงว่า Screening + ve.
การตรวจ Hb Typing  โดยใช้วิธี HPLC  
หลักการ  ใช้ Cation Exchange คือ Hb ที่มีประจุบวกจะเข้าจับ Resin ใน column ซึ่งมีประจุลบ เมื่อใช้ Bufferที่มี ionic strength ต่างๆผ่านเข้าไปใน column ประจุจาก Buffer จะไปแย่งจับกับ Column และชะ Hb ให้หลุดออกมา เนื่องจาก Hb แต่ละชนิดมีความแรงของประจุต่างกัน  จึงถูกชะให้หลุดจาก column ด้วยเวลาที่ต่างกัน (Retention time)  ซึ่งเป็นคุณลักษณะของ Hb แต่ละชนิด จึงสามารถระบุชนิดของ Hb ได้  การวัดปริมาณของ Hb ใช้ Photometer วัดคุณสมบัติการดูดกลืนของแสงของ Hb ที่ 450 nm แล้วคำนวณความเข้มข้นของ Hb เป็ร % รายงานผลเป็นกราฟ (Chromatogram) ระหว่างความเข้มข้นของ Hb แต่ละชนิดเทียบกับเวลา Retention time  ผลจากวัด Hb Typing จะได้ได้ %HbA,%HbA2,%HbF ดังตาราง
 
x +/- SD
% Hb F
% Hb A2(E)
A2A
0-1.5
2.0-3.4
A2A ( thal trait)
1-5
3.5-9.0
EFA (+ thal /Hb E)
10-30
20-50
EF (0 thal /Hb E)
15-40
40-60
EA (Heterozygous Hb E)
1-5
25-30
EE (Homozygous Hb E)
1-10
90-100

ตัวอย่าง Chromatogram

A2A ( Normal)
A2A ( thal trait) (A2>3.5)
EFA (+ thal /Hb E)
EF (0 thal /Hb E)
EA (Heterozygous Hb E)
EE (Homozygous Hb E)
Hb H
Hb Constant Spring (CS)
Hb Bart's